浙大牟颖：精准医疗中的核酸精准定量工具

摘要

8月9日，火石百家邀请了浙江大学牟颖教授，为大家分享了“精准医疗中的核酸精准定量工具——微流控数字PCR”。此次分享主要涉及数字PCR的定义、数字PCR的杀手锏、微流控数字PCR仪器现状以及数字PCR在精准医疗领域的应用。

分享环节

数字PCR概念的提出

聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）是基因检测的最主要技术，解决了过去无法获得足够量核酸的难题，但是核酸拷贝数的精确定量一直是困扰人们的难题。

目前作为传染病诊断金标准的核酸定量方法是实时定量PCR（qPCR）技术，但它是依靠标准曲线或参照基因来测定核酸量，是一种相对定量技术。在低拷贝靶分子、模板浓度差异细微时，其检测灵敏度、精确度都受到了限制。作为第三代PCR技术的数字PCR，直接计数目标分子，不再依赖任何校准物或外标，可确定低至单个待测分子的绝对数目。 

数字PCR（digital PCR，dPCR）概念由美国科学家Vogelstein和Kinzler在1999年明确提出。它采用“分而治之”“各个击破”的策略，通过将微量样品做大倍数分级稀释和分液，直至每个细分样品中所含有的待测分子数不超过1（0或1）个，再将所有细分样品在相同条件下进行PCR扩增，使含有1个目标分子的细分样品中的目标分子放大几百万倍，产生非常强的荧光信号，然后对发生了扩增反应的细分样品进行计数，使用泊松统计将阳性信号的计数转换为一个绝对值，即获得原始样品中所含目标核酸的绝对定量拷贝数。 

数字PCR的特点

▶ 高灵敏度：单分子信号放大、消除背景噪音 

▶ 高准确性：绝对计数初始样本分子个数 

▶ 最低检测限低：单拷贝量

 “分而治之”的策略使得一个样品的数字PCR反应需要成千上万个试管完成，工作量巨大！如何解决呢？

数字PCR的本质就是通过大规模的平行荧光PCR扩增，将微弱的扩增信号从背景噪音中精准地提炼出来。微流控技术的发展为解决如何获得足够数量的平行荧光PCR成为实现数字PCR提供了出路，它为数字PCR提供了成千上万个飞升-纳升的反应单元。数字PCR灵敏度与分配单元数成正比。

数字PCR的市场前景

各国科学家们致力于数字PCR的研发，已诞生了多种dPCR装置，如液滴式、旋流片式、滑动芯片式、集成流路芯片式等。商业化的dPCR平台也在不断面世。

国内一些科研单位和公司也进行了相关研发，致力于高端仪器国有化、低成本化。我们的课题组在2012年研制出自吸进样式数字PCR芯片，像真空采血管一样方便进样，并研制了数字PCR检测系统，这个项目还在进行中。

据DeciBio预计, 2016年生命科学仪器市场将达到$458亿，中国是最强驱动力。一个高增长的技术领域是数字PCR，该技术的复合增长率将飙升至90%，从2011年的1000万美元升至2016年的2.5亿美元。据Frost &Sullivan预计，2011-2016年间数字PCR仪器市场将以52%的年均复合增长率增长。

精准医学面临的挑战以及数字PCR的独到应用

当今医学模式正在由疾病医学向健康医学转化。本世纪初，Lee Hood 提出的“4P”医学，即预防医学（Preventive Medicine）、预测医学（Predictive Medicine）、个体医学（Personalized Medicine）和公众参与医学（Participatory Medicine），不论是对肿瘤的预测还是个体化治疗，均急需针对性的分子检测技术。

未来分子检测除了用于疾病的预测及早期甚至超早期诊断外，还将用来指导常规体检，让常规体检更加有的放矢，从而改变健康管理的观念。此外，它还可以用来指导人们管理疾病，进而指导安全用药，帮助医生定制个性化治疗方案，以便更加有效地治疗疾病。精准医学的目标就是个性化医疗，因此亟需敏感度高、准确性好的分子检测方法。

精准医学面临着艰巨的挑战： 

（1）样品少 ：2-3 mL母血有1个胎儿细胞；母体血液中的胎儿游离DNA；1mL全血有1-100个循环肿瘤细胞（CTC细胞）；循环肿瘤DNA……

（2）干扰强：肿瘤通常包围在大量的正常组织细胞中，而且肿瘤存在异质性，待测基因周围存在数万倍的其它干扰； 

（3）最好的DNA 扩增试剂也难以从30,000个野生型分子中检测出1个突变分子；每个PCR反应最少不能少于10个分子，其误差在5%以上； 

（4）实时定量PCR（qPCR）无法分辨2倍以下的基因表达差异或拷贝数变异，难以鉴定频率低于1% 的等位基因。 

数字PCR技术能测定30%以下的基因表达差异，区分单个拷贝数的变异体，鉴定频率在1‰的等位基因。因此，数字PCR特别适用于拷贝数变异、稀有突变检测、基因相对表达研究（如等位基因不平衡表达）、二代测序结果验证、miRNA表达分析、单细胞基因表达分析等不能很好地依靠Ct值分辨的领域。

数字PCR的主要应用：

（1）稀有突变检测：突变的基因通常包围在大量的正常组织细胞中，很难排除正常细胞基因的干扰；肿瘤组织存在异质性，存在100-10000倍的其他模板干扰；常规PCR在试管中大量干扰基因中检测稀少基因信息难度很大。数字PCR“分而治之”的策略，使得各个反应单元中目标分子是0或者1，使得目标分子阳性信号得以检测。数字PCR已经成功的应用于肿瘤组织内的EGFR 检测以及EGFR 突变频率的分析。数字PCR技术检测痕量的突变分子，可精确定量到单拷贝。 

（2）microRNA表达：意大利肿瘤研究中心（Fondazione IRCCS Istituto Nazionale dei Tumori）的研究团队首次利用对肺癌病人的循环microRNA进行定量检测。在血浆样本、肺癌组织和细胞系中，对5个与肺癌相关的miRNA（mir-16-5p,mir-21-5p, mir-126-3p, mir-486-5p and mir-660-5p）表达水平进行绝对定量，并验证了mir-16-5p在正常肺组织和肺癌样本中的表达有显著差异。 

（3）无创产前筛查：传统的产前诊断需要羊膜穿刺或绒毛膜取样，对母体和胎儿均有一定的危险性。胎儿有核细胞可存在于孕妇血循环中，并已被应用于非侵入性产前诊断，但由于母体外周血中胎儿有核细胞很少，每毫升仅含有1、2个细胞，且分离富集胎儿有核细胞的操作技术繁琐复杂，因此其应用受到限制。已经有研究证明可以通过数字PCR 的方法可以对游离在孕妇外周血内的胎儿DNA 进行准确分析，用来检测婴儿的21号染色体三体。这表明，在未来数字PCR 可能会取代NGS 实现临床21 三体的无创筛查。

（4）拷贝数变异：CNV改变基因表达水平有十分重要的临床意义。在有已知拷贝数的内参基因的前提下，数字PCR不但可以清晰区分一个或者两个拷贝，更可以对多拷贝基因进行分析，例如五个或者六个拷贝。在这一点上，相比于包括qPCR 在内的常规方法，数字PCR 优势明显。 

（5）测序文库绝对定量：数字PCR可以与新一代测序无缝对接，无需使用标准曲线，直接对 NGS 库执行绝对定量分析。

（6）评估基因编辑效率（GEF）：常见基因编辑评估方法包括：Surveyor检测；亚克隆结合Sanger测序；HRM分析（高分辨率熔解曲线）；NGS和数字PCR。数字PCR操作简便、快速，无需生物信息学分析支持，灵敏度高，成本低，需要专门的数字PCR设备。将GEF-dPCR方法用于CCR5基因编辑效率及CCR2脱靶效率的测定，灵敏度可达0.2%，且结果与NGS得到的数据高度一致。

总之，微流控数字PCR为精准医疗提供了核酸精准定量工具。相对于传统核酸检测技术而言，数字PCR能实现对核酸分子的高灵敏、高精准的绝对定量，是现有分子诊断技术的补充与飞跃，其所具备的应用优势势必会影响医学、生物学、食品安全和环境保护等领域的未来发展。同时，它也预示着一个拥有巨大潜能的新兴产业。

问答环节

1、 数字PCR技术相对于NGS有何优势？这两者是互补关系还是竞争关系？

牟颖教授：数字PCR可以和NGS无缝对接，无需使用标准曲线，可以直接对下一代测序库执行绝对定量分析，其优势在于精准定量和高灵敏度，因此我认为数字PCR技术并不是NGS的替代技术，两者是互相衔接的互补技术。

2、从实用角度来说，数字PCR芯片的微液滴数目大概在多少范围内合适？

牟颖教授：芯片反应腔室或液滴数的选择主要取决于不同检测需求。常见的肿瘤基因检测，1000左右已经足够；无创产前筛查等领域，1w以上的液滴数或者更高的也有一定需求，不过5w已经足够。Fluidigm公司推出的在765的芯片在一些领域已有应用；如果用于非常稀有基因的检测，目前RainDance Technologies公司已推出1000w的液滴dPCR。液滴数越多，灵敏度固然越高，但是成本也相应提高，所以还是应当按需选择。

3、数字PCR和一、二代PCR成本费用大概是什么情况？产品化区别主要是仪器还是试剂盒？

牟颖教授：从成本上说，一二代PCR用的耗材和试剂方面成本大家都比较清楚了，数字PCR的成本主要是在芯片方面，像Fluidigm公司的是500美金一块芯片。但是在试剂方面的成本，两者都是差不多的，数字PCR检测一个样品所需的试剂量甚至可能更低一点，因此产品化主要的区别还是在于数字PCR的芯片成本占了较大比重，试剂盒方面有差别，但是成本相差不大。

4、目前数字PCR对于癌症筛查应用情况如何？

牟颖教授：在癌症筛查方面，数字PCR是一个很好的技术，特别是在稀有基因的检测方面有很大优势，肿瘤本身最大的问题是肿瘤组织周围存在大量的如肿瘤异质性等因素，对于检测会造成很大的干扰，数字PCR应用“分而治之”的策略，可以大幅度降低背景噪音，因此在这方面具有很强的优势。

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