基因测序的现状与未来

火石创造：firestone-link 洞悉全球医健创新创业实践

导语：作为hsmap的重要组成部分，火石特推出KOL访谈栏目，希冀通过对创业者、投资人、产业界、政策制定者、临床或科研专家等不同角色的深度访谈， 为读者呈现更清晰生动的细分领域情况！

本期KOL访谈我们邀请到了中国基因组学科学家于军，深度解析基因测序的现状与未来！

火石创造（以下简称“火石”）日前针对基因测序的技术进展、几代测序技术的比较、RNA测序及修饰后的RNA解读，以及基因测序的临床进展、未来的发展与创新等方面对中国基因组学科学家于军进行了深度采访。

于军:中国基因组学科学家、华大基因研究中心和中国科学院北京基因组研究所的主要创始人之一；曾任中国科学院北京基因组研究所副所长。

基因测序的技术进展

火石：二代测序现在相对来说在临床跟技术上已经比较成熟，但是单细胞测序跟纳米孔测序现在还是科研阶段，可以这么说吗？

于军：这个评价不是很对，因为用纳米孔来测序的设想已经30年的历史了。早在40年前，物理学家就说可以测在单分子水平测分子结构特征，理论上讲，用物理原理是能直接读取DNA序列的。但到目前为止，这些都还在实现的过程中。目前要解决两个问题：

第一,打孔；

目标是要钻一个直径为1.5纳米左右的孔，误差肯定要在10%以下。我们现在是能打2纳米左右的洞，但是误差在0.5纳米，是用离子束打的。离子束加工是半导体工业常用的技术。相应的机器现在是德国做得最好，第二是美国，第三是日本。中国还不会做此类水平的机器，更不要说打孔了，这是目前的基本技术背景。我们打孔的技术目前已经接近理想状态，准确度再增加一点的话就更好些（孔可以打到1.5纳米左右，让它很均匀）。

第二,控制DNA通过纳米孔的速度；

DNA自由通过纳米孔的速度太快，一秒钟有差不多10万个核苷酸。如果速度慢到每秒1000个左右，就能用来测核苷酸的序列了。现在的速度是每秒大概通过一万到数千，仍然太快，其实每个核苷酸在千分之一秒以从孔里内钻出来，系统就能准确识别每个核苷酸了。纳米孔的材料大体有两种：一种是生物纳米孔，加了蛋白质的；一种是化学孔，就是什么都没加。目前有三种不同的蛋白质可以做成生物孔，但因为蛋白质覆盖的长度从15个核苷酸到30个核苷酸，这么多核苷酸一起钻过去，在电流变化区间区别不了里面的核苷酸是什么，因此生物纳米孔测不好DNA序列。最近有个新方法，把一个酶放在生物孔的洞口，再由酶把核苷酸一个个切出来，掉进去。最理想的状态是，核苷酸通过孔时横、纵都能测出序列来。

火石：现在纳米孔测序能测到什么程度？

于军：每个核苷酸的碱基电流差异较大，目前我们的测序水平已能区分出这个差异。我们可以用石墨烯再做了一个平面网，炭原子形成的平面网（石墨硒）厚度是0.3纳米，正好是一个核苷酸的厚度，在这个网面打个孔，再让洞的大小相对均匀一点，打断几个碳键就可以做到这点，但实现这个技术有一定的难度。然后要考虑它的时间分辨率和空间分辨率，因为基本原理就是用时间和空间测出速度。用现有的装备能测出不同的核苷酸数量、分布值，我们用甘油作为介质来控制它的速度，可以控制得更慢。这个如果有投资的话，三年之内我们就可以做出一个很漂亮的机器。

二代测序与纳米孔测序的比较

火石：二代测序与纳米孔测序有什么不同？

于军：二代测序仪所用技术不同，但是大部分序列都测得太短。人类基因的平均长度大概是2000 bp，目前的高通量测序仪只能测一百个bp左右的小片段。但最大的基因家族有上千个基因，他们的序列都很相似，测得的小片段如果都很相似的话，这些基因家族就难以区分。在过去的20年里，我们一直在研究转录组，了解转录组研究的难点。

我们目前基本解决了能用真实数据解释的科学问题，剩下的都是数据本身不能解释的问题。比如，如果只有小片段序列，就很难知道这个小的是属于哪一个基因家族的成员。所以就不能实现达到一定的分辨率来研究单细胞的全部转录组以及细胞转录组与癌症的直接关联。

目前，纳米孔技术不仅可以做2纳米的孔，而且也很均匀了。但这个孔是氮化硅的，还比较厚，所以我们要用加一个石墨烯膜。然后，我们把DNA或RNA放在一个空间里，让它们从洞里钻过。在目前已有的机器上，DNA钻得很慢，因为要等一个DNA分子钻过，实际上100秒里只有1秒的时间里有DNA钻过去，剩余的时间都是水在钻过。我们还设计了微流控装置，就是要做一个较复杂的洞，让DNA或RNA在洞里有序地排好，一个个钻进来，这样效率就提高了。测序技术的下一步需要有微流控、纳米和光电技术前沿的交汇。我们还在做一个设备，希望能利用拉曼光谱实现核苷酸指纹图谱的鉴定，还要通过纳米孔使机器的分辨率更好。

火石：微流控的过程会用到试剂吗？

于军：就是缓冲液加甘油，没有别的东西。过去我们第一代测序仪用的是桑格法，用到分子杂交、酶反应、荧光标记、电泳、PCR等；

第二代增加了微反应池，还用到荧光信号处理和激光；第三代单分子DNA测序技术中，杂交是用的，还用了蛋白质纳米孔、DNA合成酶、荧光标记、微流控等；第四代用的就只是微纳加工了，还有单分子电学和光学，也不需要扩增DNA了。

RNA测序 vs. DNA测序

火石：从疾病诊断来看，是DNA的测序与RNA的测序哪个更重要？目前你们的机器都能测吗？

于军：DNA和RNA序列的信息同样重要。DNA序列和RNA序列有些信息是一致的，但是有些是不同的。RNA序列信息要复杂一些，每个细胞之间都有差别。RNA有更多的化学修饰，100余种；DNA目前只有几种化学修饰。就序列的测定原理而言，能测RNA就能测DNA，也就是说RNA测序比DNA测序复杂。现在我们已经开始实现RNA测序。DNA测序和RNA测序目前还是不同的技术，但是将来又可能用一个仪器就可以了。

火石：这个机器最理想的状态大概是什么时候拿出来？

于军：目前我们的机器在申请国家的基金，三到五年后要拿出一个原理机。然后是产业化。如果过程中有资本进入的话，进入市场的时间会短一些。

修饰后的RNA解读

火石：三代测序能把修饰以后的RNA完全读出来？

于军：现在的DNA测序技术都是间接测定RNA的序列，因此RNA的化学修饰部分是读不出来的。纳米孔能读成什么样还不是很清楚，但我们有信心能读出来。目前已经知道有部分RNA分子经过化学修饰，比如核糖RNA。然而，90%以上的核糖体RNA其实是用来做能量控制的，不是用来做核糖体的，所以修饰的部分代表着一个重要的分子调控机理。我们很早就在研究这个机理，目前已经解决了细菌能量控制和化学修饰的一些问题。但真核生物比较复杂，因为原核生物什么都是在一个空间里管的，真核生物的能量控制是专门由线粒体管。tRNA的化学修饰很重要，因为从细菌到人都有这些修饰，说明是非常古老的机制。目前我们对它的了解还太少，现在的方法是把tRNA拿出来，然后用质谱测，大约知道有修饰存在，但是搞不清楚在分子水平是怎么修饰的。

火石：二代测序读不了修饰以后的RNA？

于军：二代测序不能直接测RNA的序列，而要根据逆转录后产生的DNA序列推出来，目前还没有RNA直接测序的技术。因此，我们的技术可以说是最为前沿的技术－－直接实时测定RNA序列。要实现这个目标，上游的微流控技术比测序还要复杂，要把RNA或DNA排列在一起。因为它涉及到RNA的分离，需要按大小分离，从一个孔出来的时候要给它足够的时间和定量。可见，微流控技术非常关键，它涉及到微纳加工和流控，还要在洞的某个部位有一个很窄的口，把单链和双链分开。加工挺复杂，但是它的本质就是半导体加工工艺，像电脑芯片的制作一样。

三代测序的应用

火石：三代测序做出来以后主要会应用在哪些方面？单细胞测序解读也要有专门的工具吗？

于军：临床应用包括诊断和指导治疗。癌症发生的原因现在基本上分两种，一种是遗传变异，一种是转录组基因表达的变化。现在的二代测序技术也能测遗传变异，但就转录组测定而言，还不够好。比如，从单细胞出来的RNA组，测完所有的RNA，得到全部序列，就是RNA组了。RNA较短，也比较稳定，断链的可能性不大。

火石：现有的CTC、CtDNA液体活检技术结合你们的新技术，效率会高很多吗？

于军：我们的技术是在单细胞水平，上游还有微流控装置让RNA从单个细胞走出来，然后做一个洞（纳米孔），让RNA钻过去，把一个细胞的所有的RNA都测一遍，产生的标记物要比传统的标记物复杂。而RNA序列以外的标记物，比如RNA化学修饰本身也会告诉我们这个细胞的能量水平和状态是怎么样的，因此，得到的信息比现在的技术更多。

基因测序的临床进展

火石：现在液体活检跟二代测序结合有临床意义吗？

于军：现在二代测序是希望通过测序定点扩增或捕获后的DNA来应用于临床，单细胞DNA测序还很难。

比如我们找出一百个细胞，从每个细胞里抓取10%的基因来测序，然后期待用这些信息将一百个细胞的基因实际表达谱给出来。但这个数据的分析要运用很缜密的算法，取样越多算法越简单。从理论来讲，液体活检只是用来证明临床的结果，常用于手术后的复发监测。

火石：二代基因测序的临床应用还比较少吗？

于军：也不能说少，只是有些还不成熟，或没有一个统一标准。比如儿童肿瘤一大部分都是血液的，都要用测序方法来分型，要确定特定的基因变异。就肺癌等恶性实体肿瘤而言，要用测序来确定是哪个基因突变，哪些基因表达异常。还有一些实体肿瘤，比如垂体瘤，小孩患者多，恶性程度不同，基因变异和表达的信息可以用来指导治疗。

火石：现在利用基因测序的方法去对原发灶不明的癌症进行研究，目前有什么进展吗？

于军：原发灶活检基于组织学，一般可以用转录组数据来评价，看基因表达有没有异常。但这也是一个比例，比如某个基因标记物在10%的什么癌症细胞里表达，它就可以作为分子标记物来做筛查，避免癌症发现得太晚。

医学上有很多这样的例子，单一基因测序结果很难明确诊断癌症，还得结合其它检查，所以基因诊断本身很难变成临床上的一个金标准。

火石：基因测序能不能被国家加入肿瘤治疗的临床路径里去？

于军：现在还不确定。每个省的医疗保险单都有支付必须检测的遗传病。这个不一定是国家说了算，各个省说了算就行。比如南方人要查的病和北方要查的病可能有所不同。美国是有多种必检测的遗传疾病，政府提供无偿检测。美国的医疗系统跟中国的不一样。他们的儿童医院是国家按照人口密度设的，儿童医院的开销是保险公司支付，所以各个州纳入保险范畴的的检测是不同的，各个州自己确定。

发展与创新

火石：如何才能提高测序的效率？如何创新？

于军：这是两个问题。提高效率，是指目前的二代主流仪器；创新，应该指的是未来技术。其实，现在的二代仪器都有很多改进的余地, 比如光学图象的获取和处理技术; 芯片也可以加工得更好一点, 比如质料、物理性能等。

原始创新的部分很难，需要有基础以及较大的投资力度。美国“击鼓传花”式的早起投资环境，在中国还没有形成。我早就声称：只要有三个亿人民币，我就可以做一台超过目前二代主流测序仪的新仪器。目前还无人应答。

基因测序的业态

火石：中国的业态发展现状如何？基因测序在中国是产业吗？

于军：中国有好些小的分子诊断或基因诊断公司，但大都是“初具规模”。有些没有适当资质的企业，还只能做些健康咨询类的服务。产业、业态等问题其实不是技术问题。中国管业态的是发改委；管行业的是卫计委。发改委要批准30个基因检测的试点，就是基因检测和分子诊断在中国变成业态的第一步。