ctDNA在肿瘤诊断和治疗中的应用

2016
05/23

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火石创造
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5月7日,由火石创造发起的一场Link投资人与创业者的巡回沙龙——精准医疗之肿瘤与液体活检(北京站)成功举办,众大咖围绕火石创造大数据库发布的液体活检全球地图(hsmap)进行了深度讨论。

摘要:5月7日,由火石创造发起的一场Link投资人与创业者的巡回沙龙——精准医疗之肿瘤与液体活检(北京站)成功举办,众大咖围绕火石创造大数据库发布的液体活检全球地图(hsmap)进行了深度讨论。

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在“液体活检”沙龙(北京站)中,关于液体活检的重要分支——ctDNA在肿瘤诊断和治疗中的应用,国家癌症中心李文斌带来了精彩分享。

PPT近40页,均为嘉宾深度干货,若想获取PPT全部内容,请分享本文,截图并回复至公众号。)





李文斌

从一个大的层面讲“肿瘤的精准医疗及液体活检”,我认为可能会不够全,所以今天我将从具体的工作实践以及相关的工作体会中讲一些细节,首先我想跟大家说一下精准医学时代下的肿瘤分子病理检测。


肿瘤分子病理检测最主要的作用是分子病理指导下的靶向治疗能显著延长患者的生存期

1.1 左图显示的是乳腺癌的HER2治疗,这是最早在临床上应用的抗肿瘤的一个靶向治疗药物。我们可以看到乳腺癌患者接受了HER2的基因检测,不管是免疫组化的方法还是FISH的方法,在治疗之后他的生存期都可以得到很大程度的延长。

1.2 目前发展最为迅速的肺癌的靶向检测为EGFR基因突变的检测。这类检测所应用的临床靶向药物,比如易瑞沙(吉非替尼片)、特罗凯(盐酸厄洛替尼片)或者我们国产的凯美纳(盐酸埃克替尼片),这三种药物的应用都能极大地延长EGFR基因突变型(就是敏感突变)患者的生存期。

现在最新的ALK(间变性淋巴瘤激酶),有异位表达的患者大概占所有肺癌人群的7%到10%,我们的数据是9.7%,这9.7%的病人用ALK抑制剂(克唑替尼或二代的抑制剂)之后,生存期也可以得到很大程度的延长。以往这种ALK阳性患者的生存期很差,因为这类肿瘤往往是实体型肿瘤,恶性程度比较高。

1.3 另外,在结直肠癌的靶向治疗领域,爱必妥(西妥昔单抗)的应用也可以极大地延长RS阴性以及BRS阴性患者的生存期。

2. 分子病理检测可以辅助肿瘤的精准诊断。

比如说,淋巴瘤的基因重排或是EWSR1的FISH检测能辅助软组织肿瘤的诊断,也就是说,在传统的形态基础上加入分子检测可以让肿瘤的诊断更加精确。

3. 分子病理检测也有助于肿瘤的分子分型。

比如说,乳腺癌不同分子分型的病人对于化疗或内分泌治疗的响应可能是不一样的。有些分子分型(比如三阴性乳腺癌)的预后差,对化疗或内分泌治疗的响应也不太好,但是RA或者RB型的乳腺癌患者预后就非常好。

所以,今天我想在肿瘤分子病理指导精准医疗的基础上跟大家分享以下几点:

第一,肿瘤分子病理指导下的肿瘤靶向治疗

第二,液体活检的概述

重点分享

液体活检技术潜在的临床应用方向;

另外,比较关键的一点是如何进行规范化的分子病理检测及液体活检

分子病理指导下的肿瘤靶向治疗 

关于靶向治疗,我们可以介入到肿瘤治疗前、治疗中、治疗后这三个不同的阶段:

第一,治疗前的肿瘤组织标本以及细胞学标本,可以进行肺癌的基因突变检测或FISH检查,跟组织病理学配合进行靶向筛选。

第二,在治疗中,液体活检真的可以大胆地施手,对血液和体液标本进行疗效的动态监测。

第三,治疗后。虽然跟普通的化疗相比,目前的靶向治疗可以延长病人的生存期,但它最大的问题是所有靶向治疗的患者都会产生耐药。

比如肺癌的患者服用易瑞沙(吉非替尼片)、特罗凯(盐酸厄洛替尼片)一般一年左右的时间就会产生耐药。所以液体活检给我们提供了很好的机会。

对于这些耐药患者,用液体活检的标准进行基因组学的检测,看它耐药的原因,然后针对耐药的靶点进行治疗。但是所有这些对于临床来讲都需要规范化、标准化以及在有室内质控和时间水平的环境下进行的。

这里给大家简要介绍一下肺癌靶向治疗的相关基因检测:

刚才提到的EGFR是现在是肺癌治疗领域的一个明星分子,EGFR突变可以用乳氨酸免疫抑制剂还有2007年发现的ALK分子在肺癌中和EML4(棘皮动物微管相关类蛋白4)融合,至今不到十年的时间。但是这个药发展很快,目前已有二代产品,一代是克洛替尼,二代是埃罗替尼。

另外还有MAP基因,MAP基因的基因条例数增加也有相应的靶向治疗药物。而最新FDA批准的是针对Ros1的一个靶向药物——克唑替尼,但是Ros1的定位很少。

KRAS在肺癌里的突变率大概是5%到7%,但是KRAS突变不能够用EGFR的TPR进行治疗的,而且KRAS突变的这些靶向药物目前主要还处于研究中,很少应用于临床。


除了肺癌之外,还有一个跟基因检测密切相关的癌,就是结直肠癌,但是目前指南批准的主要是用于转移性的结直肠癌,也就是四期的结直肠癌。对于早期的结直肠癌我们不推荐用靶向药物治疗。

结直肠癌检测的基因主要是Ras基因,Ras基因是一个家族,它包含了各种Ras基因,最开始主要是进行KRAS的检测,但是在去年,不管是美国的指南还是欧洲、日本的指南都推荐进行全Ras基因的检测。

现在我们所能做的除了Ras基因之外还有非Ras基因的检测,目前有一些临床实验表明非Ras基因突变对于肠癌的靶向治疗也是一个耐药分子,但是还没写在指南里。


分子病理实验室基因突变检测一般的操作流程是这样的:


目前基于组织标本的检测,比如手术标本或穿刺活检的组织,病理科会对肿瘤标本自备,我们有一个完整的标准自备流程,因为标准自备会影响到后期基因检测的结果,因此,

第一步的肿瘤标本自备和病理学形态评估非常重要;

第二是DNA的提取和质量控制,有些标本可能制得很好,但是DNA提取过程不行,也做不出来;

第三是进行基因突变的检测,RaX检测是现在临床上最常规和简便易行的方法;

第四是结果分析和检测报告:所有这些都需要质量控制。

基于外周血的基因突变检测,现在常规做的是组织病理检测和胸腹水,当然胸腹水得经过细胞血,就是具有发细胞病例资质的医生确认胸腹水里面有肿瘤细胞才可以进行检测。

但对于这种手术切除的冰冻组织我们一般不推荐,因为一般只有等到福尔马林固定标本之后才可明确地区分它是腺癌还是鳞癌,而这个分型对于肺癌非常有意义。肺癌的突变和这些靶向药物主要用于腺癌病人,鳞癌病人目前没有特别好的靶向药物。

我们现在认为外周血的突变检测是一个很好的发展方向,但是可能还需要做一些工作才能够真正在临床上推广应用

液体活检的概述

关于液体活检的概述,之前肿瘤学专家已经讲了很多。

大家推测血浆中游离DNA来源于肿瘤组织坏死、凋亡及分泌,ctDNA的长度是大约170个BP,它含有肿瘤特定的基因突变。

这是在不同类型的肿瘤ctDNA检测中的应用,不光是用于基因突变,它还可以甲基化,做拷贝数变异:


ctDNA检测的特异性为100%,而敏感性从50%到75%不等,所以我们得用更精确的方法去做ctDNA的检测。

通常一代测序的敏感性为10%左右,也就是说一百个肿瘤细胞里面小于十个细胞有突变是检测不到的。

另一个是二代测序,去年刚在广州发布了二代测序的指南,但是二代测序现在在临床上大规模应用还处于实验阶段,没有真正用到临床检测上。

然后就是定量PCR,之后就是RM方法,RM方法现在是临床使用规模最大的一种基因突变检测的方法。为了达到液体活检的准确性,我们可能需要更精确的测序方法。

但是,因为灵敏性提高的时候,特异性可能会下降,反之亦然。所以我们需要在特异性和灵敏性的选择上进行平衡。当然,这种平衡在不同的肿瘤、不同肿瘤的不同亚群以及在不同的检测时间和检测方式上都会不同。

液体活检技术潜在的临床应用方向

下面再跟大家简要介绍一下液体活检潜在的临床的应用方向。

一、液体活检-克服肿瘤异质性问题 

二、液体活检-靶向治疗耐药监测 

三、液体活检-检测肿瘤治疗效果 

四、液体活检-肿瘤早期诊断 

第一个应用方向:液体活检可以克服肿瘤的异质性问题

肿瘤的异质性是在基因检测和治疗过程中面对的一个最大的难题,主要分为几个方面:

第一,每个不同个体之间的肿瘤有异质性

第二,同一块肿瘤的瘤体内的癌细胞之间也有异质性;比如乳腺癌,一块是一种病理类型,一块又是另一种类型,这也就是瘤体内癌细胞的异质性,这种抑制性在肺癌、乳腺癌、结直肠癌里面都很常见。第三,原发灶和转移灶之间的抑制性;比如从原发的肺转移到脑部或者淋巴结时,在基因层面上,继发灶和原发灶肿瘤之间往往存在异质性。第四,不同的转移灶之间的异质性;比如说结直肠癌的肝转移,肝上可以形成很多的病灶,每个转移灶之间也有异质性。

异质性从哪来?

一是原发灶早期中的亚克隆,不同的克隆会产生不同的基因突变的类型;

二是,所有的治疗都是一种外界压力,从进化角度来说,当你对靶向治疗或化疗给予进化压力的时候,耐药性最强的癌细胞往往都存活下来了,而耐药性不强的细胞都死了。耐药性很强的细胞存活下来了就会产生不同的基因突变。

因而,ctDNA究竟能不能够反应组织学上的肿瘤异质性问题也是很多人想研究的地方。

我在一个专业的医学搜索期刊文献的网站上没有找到关于ctDNA对于肺癌或者结直肠癌的异质性的报道,但找到一篇关于乳腺癌的,这篇文章的结论是:ctDNA能准确反应转移性乳腺癌原发灶和转移灶基因突变的变化,也就是说ctDNA可以反应乳腺癌的肿瘤异质性。


第二个可能的潜在应用方向是:液体活检的靶向治疗和耐药监测。

靶向治疗所有的病人都会耐药,耐药之后的治疗怎么办,什么时候耐药,这是非常值得关心和研究的一个点。一是因为融合基因的地方有基因免疫的突变,基因免疫突变后病人对之前的药物不再受用。

另外,比如说肺癌的EGFR的TGM突变占到耐药机制的50%,但也不是全部。它的耐药机制还包括比如说基因的扩增、CNA拷贝数的变化,我们只能用液体活检加二代测序这种测得更深更广的方法来实现耐药监测。


另外,对于没有突变的病人用药,一段时间之后也可能产生新的基因突变。

所以说靶向治疗的耐药监测是液体活检可能是很好的应用方向。

液体活检还有一个重要的应用方向:检测肿瘤残存病灶和治疗效果。

肿瘤标志物的检测也叫血液检测,但血液检测和肿瘤标志物检测哪个更优呢?这篇文章中告诉我们,CTDNA可能优于现在的蛋白检测,因为DNA的变化更灵敏和更精确。


另外还需要注意的问题是,适用范围是四期结直肠癌,直肠癌肝转移的患者可以通过ctDNA可以有一个很好的疗效监测。

对于二期的结肠癌的患者,CTDNA的方法可能永远看到这个病人活得很好的,为什么?因为二期的结直肠癌患者生存率很好,而且术后很多患者不需要经过其他任何治疗,手术做完就没事了。


另外,液体活检可以监测肿瘤的动态变化及预测复发,这是一个肿瘤的负荷,我们可以看到曲线图,肿瘤的变化跟ctDNA的变化能够很好的符合。


液体活检能不能用于肿瘤的早期诊断?


如何进行规范化的分子病理检测及液体活检

最后跟大家简要的说一下规范化的分子病理检测及液体活检。所有的分子病理检测以及诊断的目的是跟临床疗效直接相关的,临床疗效是评价分子病理检测平台和技术的金标准。



这是国外2016版ECC指南推荐的肺癌的基因检测,它推荐的是必须在FDA批准的实验室进行分子检测,这涉及到标准和规范的问题。


我国我以肺癌为例,肺癌的EGFR突变检测的专家共识在2011年已经发表了,在去年也发表了肺癌的血液基因突变。

总结一下,这也是我从共识里面摘抄的话:


最后想跟大家说的是,任何的分子病理检测,检测的标准与规范一定是放在首位的,技术可能都是用了很多年的技术才能方便易行、标准规范,真正的应用到临床检测中。

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关键词:
ctDNA,肿瘤,诊断,活检,检测,液体,肺癌

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