从“人耳鼠”到“3D打印” 活体打印还有多远？

前不久，日本政府批准第一例人兽杂交胚胎实验震惊了世界，这也是世界首例获批的人兽杂交实验。

（Nature对此事进行的报道）

本次获批培养人兽杂交生物的研究者是东京大学医学科学所的教授中内啓光，他对外界宣称：培养人兽杂交生物的最终目的，是让这些动物能够长出适配人类的器官，在器官移植当中作为器官供体，解决目前移植器官紧缺的问题。

且不说人兽杂交胚胎涉及的伦理问题，目前器官移植问题难道不能通过其他途径解决么？

一、长在老鼠身上的耳朵

1997年，一只背上长了人耳朵的老鼠震惊了全世界。而让世界震惊的并不是中国人把科幻片中出现的怪兽带到现实，而是因为人耳鼠的出现给无数器官残缺的病患带来了重获健康的希望！它和克隆羊一样，是生物科学的里程碑！

 （图片来源于网络）

2001年，这只“背上长着人耳朵”的老鼠在北京举办的国家“863”计划十五周年成就展亮相，名噪一时。这只“人耳鼠”培育自上海交通大学教授、交大附属第九人民医院副院长曹谊林之手。

打造这样一只人耳鼠，曹谊林教授利用异种关节软骨，通过组织工程构建人形耳廓软骨，裸鼠皮下植入等技术。先使用可降解材料经过耳形压模，聚乳酸(PLA)溶液浸泡使其强度增强，制成耳廓支架材料。让细胞在其支架上繁殖生长，再将细胞接种于支架材料，经过1-2周体外培养，在裸鼠背上割开一个口子，植入"人耳"。随后，"人耳"的支架会自己降解消失，"长"在老鼠的背上。

二、3D打印人耳临床试验成功

二十年后，当人耳鼠逐渐淡出群众视野的时候，2017年5月，国家组织工程中心曹谊林团队生物打印的耳廓软骨，郭树忠团队在北京大学国际医院的临床试验成功。这个试验的成功，标志着我国生物打印器官技术在耳科领域的突飞猛进，生物打印也标志组织工程逐渐成熟。

（图片来源：孙建军教授主题报告）

三、创造奇迹的组织工程

无论是人耳鼠还是生物打印技术，都属于“组织工程”和“再生医学”的范畴，这是1987年美国国家科学基金会根据美籍华人冯元祯建议正式提出的。是指运用工程学结合生命科学的远离与技术，探讨正常和/病理状态下人体结构功能及其相互关系，研究生物替代物，以恢复维持和改进组织功能。20世纪90年代，各国开始关注组织工程研究，中国组织工程研究始于1994年，1998年提出“原位组织工程”概念。到21世纪，组织工程研究快速发展，部分产品已应用于临床。

（一）组织工程三要素

1.种子细胞：体外或在体培养，可增值分化形成特定组织或器官。

种子细胞包括体细胞、胚胎干细胞和成体干细胞。其中体细胞来源有限，扩增效率低，传代少，易变异。胚胎干细胞尚无法诱导使其分化为某一单一细胞，同种异体来源干细胞仍存在免疫排斥，成体干细胞包括MSC、NSC、HSC，易于大量扩增，具有多向分化潜能。

种子细胞一般来源于自体、同种异体、异种组织细胞，首选自体组织。

2.生物材料：天然或人工合成，良好的支架应该具有生物相容性、可吸收性、可塑性、表面化学特性和表面微结构利于细胞粘附和生长、可根据不同细胞组织再生速率调整降解速率。

3.调控因子：促进或诱导种子细胞定向增殖、分化、构建为所需组织、器官。

（二）关键技术：

1.3D打印：

（1）体外构建：将细胞与生物支架在体外3D培养形成完整新生组织器官体内移植；

（2）体内构建：将体外初步培养的组织器官移植，体内继续培养，生物材料在体内降解；

（3）原位构建：直接将复合支架系统移植于体内，局部募集种子细胞原位构建组织。

2.旋转生物反应器（RCSS）：应用微载体技术大规模细胞扩增的新型培养系统，该系统基于美国NASA模拟空间微重力效应而设计的既可用于微载体大规模细胞培养，又能培育细胞与支架形成三维空间复合体。迄今为止已成功培养近百种细胞。

3.原位组织工程：是指运用组织工程基本原理与技术，通过特定方法诱导缺损组织局部成体干细胞与体细胞定向迁移、增殖、分化，整合细胞外基质形成新生组织。

技术优势：利用体内微环境和精准调节基质在缺损局部供养种子细胞，避免传统体外培养扩增、诱导分化的污染、传代变异问题，利于重建组织血管化，有效优化种子细胞营养来源，避免传统移植的局部缺血、乏氧造成的细胞死亡。使用范围包括细胞再生能力较强组织，如粘膜上皮、骨骼；解剖结构复杂，组织成分多样的器官；含气结构的组织损伤，如耳鼻咽喉、胃肠等。

四、耳科组织工程的发展

耳组织解剖结构复杂，组织成分多样；基本框架由骨及软骨组织形成；多于外界交通，大量含气窦腔，内附粘膜上皮；缺损组织体积较小（听骨、耳廓缺损、骨膜）；承重、载荷等物理学要求相对较低。

耳组织不同的结构需要不同的技术机型构建：

（一）耳廓软骨构建：

多种原因可发生耳廓畸形或缺，如先天性小耳畸形、外伤、炎症等，耳廓重建手术目前仍然存在一些挑战。耳廓软骨重建需要制备多孔耳廓外形生物材料；与软骨细胞符合体外培养；植入体内，形成血管化新生软骨。

1997年，曹谊林教授等^[1] 以聚羟基乙酸为支架材料，接种牛关节软骨细胞，首先在无免疫排斥能力的鼠体内形成了形态精确的人耳形态软骨。研究表明将软骨细胞接种于可降解三维支架上植入体内，可以形成新生软骨组织, 这些研究为应用组织工程技术进行耳廓修复提供了有价值的实验资料。

（二）乳突气房构建：

乳突气房发挥着气体交换、物质分泌、废物排出、维持中耳腔通气的功能 。乳突黏膜表面分布着丰富的毛细血管网, 乳突腔并不仅仅有气体贮藏的作用，还如同肺泡一样发挥着气体交换的作用^[2]。

乳突气房重建步骤为：多孔支架材料（胶原/凝胶包被+HA）准备、生物材料扫描电镜观察、乳突根治术后植入术腔、次期复查时见材料表面覆盖新生粘膜，形成新生乳突气房。

（三）骨膜组织构建：

鼓膜穿孔主要由慢性化脓性中耳炎及外伤引起，目前临床上常采用鼓膜成形术进行治疗。移植材料多选用自体组织或经过处理的同种异体组织，虽有较高的修补成功率，但仍有无法克服的局限性，如牺牲正常组织，造成二次创伤；材料来源有限，不可能重复获得；异体组织免疫排斥反应等。

组织工程可将皮肤成纤维细胞与皮肤角阮细胞加入胶原壳聚糖共混膜，体外构建TE化鼓膜。

（四）听小骨构建：

虽有多种材料用于听骨缺损修复，但各有缺点。异体或异种材料常导致机体排斥；自体材料不仅造成机体取材损伤，还有可能被机体破坏吸收，远期效果不理想^[3]。

组织工程技术的发展为听骨缺损重建提供了新的思路和可能：自体组织干细胞原位迁徙、降解可控性组织工程支架、影像重建+数据转换+材料堆积、活体移植诱导成骨。

（五）上皮组织构建：

目前组织工程皮肤研究进展迅猛，新西兰大白兔外耳道壁全层皮肤模型的建立为临床研究提供了新的思路与依据。

小结：3D打印，前景广阔

三维(3D)打印是当今科研界乃至商业界的一大热点，被认为是第三次工业革命或制造业的新突破点。人体器官打印已被当做概念股炒作上市，吸引了无数人的注意。但器官3D打印还处于刚刚起步阶段，需要做的工作很多。尤其是复杂器官打印面临着巨大的困难和挑战^[4] 。

（图片来源：图虫创意）

3D打印医疗应用分为“三层级”，初级是利用金属、塑料等非活体组织材料的定制化假肢、听骨、牙科、骨科植入物、助听器外壳等；中级是打印上皮、血管、软骨组织类单一细胞；

顶级水平就是3D打印人工肝脏、心脏等人工器官，在组织、器官培养过程中完成三维立体构建，规划细胞按预先设计的空间排列生长。相信3D打印在医疗领域的应用会越来越广泛，“微创外科+活体打印”的新模式未来可期。

（图片来源：孙建军教授主题报告）

参考文献：

[ 1] Cao Y, Vacanti JP, Paige KE, et al .Transplantation of chon- drocytes utilizing a polymer-cell construct to produce tissue-en- gineered cartilage in the shape of a human ear[ J] .Plast Re- constr Surg , 1997 , 100(2):297-302.dicussion 303-294 .

[ 2] Yamamoto Y.Gas exchange function through the middle ear mucosa in piglets:comparative study of normal and inflamed ears[ J] .Acta Otolaryngol , 1999, 119(1):72-77 .

[3]李雪盛，孙建军. 组织工程学技术在耳科的研究进展[J]. 山东大学耳鼻喉眼学报,2009,03:30-33.

[4]王镓垠，柴磊，刘利彪，赵欣如，许雨帆，周新伟，张伟明，王小红. 人体器官3D打印的最新进展[J]. 机械工程学报,2014,23:119-127.

本文根据海军总医院全军耳鼻喉头颈外科中心首席专家孙建军教授在“2019中国耳鼻喉头颈外科学术研讨会华中高峰论坛”上的主题报告和以上文献整理，部分图文来源于网络，如有侵权，请联系删除。