人类阿尔茨模型研究再进一步？APP/PS1基因敲入结果显示…

阿尔茨海默病（AD）是具有 β - 淀粉样蛋白（Aβ）沉积、神经元丢失和神经炎症等特征的神经退行性疾病。然而，现有的 AD 动物模型，像那些过表达家族性 AD 突变的转基因小鼠，因非生理性过表达以及在免疫活性背景方面的不足，难以如实模拟人类 AD 的免疫反应机制，造成临床前研究与临床试验结果的脱节。鉴于此，开发更加贴近人类疾病病理和免疫特征的新型模型显得尤为重要。

2025 年 2 月，《Alzheimer's & Dementia》在线发表了一篇名为 "Amyloid precursor protein and presenilin - 1 knock - in immunodeficient mice exhibit intraneuronal Aβ pathology, microgliosis, and extensive neuronal loss" 的研究论文，这项研究由 Howard E. Gendelman 团队开展。研究人员在免疫缺陷小鼠中敲入淀粉样前体蛋白（APP）和早老素 - 1（PS1）基因突变，成功构建出一个展现神经元内 β 淀粉样蛋白（Aβ）沉积病理、小胶质细胞增生和广泛神经元丢失的阿尔茨海默病（AD）模型，为研究人类免疫反应在 AD 中的作用带来了新的工具与平台。

文章亮点

1、新型敲入模型：首次在免疫缺陷NOG小鼠背景中构建APP/PS1双敲入小鼠，其基因的表达由内源启动子调控，避免了传统转基因模型的过表达假象。

2、神经元内Aβ病理：模型重现了AD早期神经元内Aβ沉积及其神经毒性，填补了传统模型依赖细胞外斑块为特征的不足。

3、广泛神经元丢失：模型首次在小鼠中模拟了AD患者典型的广泛神经元丢失和脑萎缩表征，突破了传统模型仅表现局部神经元损伤的局限。

4、免疫系统人源化潜力：该模型支持人类免疫细胞的重建，为研究阿尔茨海默病中人类免疫反应的影响提供了新平台。

CRISPR/Cas9 基因敲入技术（CRISPR/Cas9 knock - in）是一种基于 CRISPR 基因编辑系统的精准基因编辑手段，通过在基因组特定位置插入或替换特定 DNA 序列来实现对基因组的定点修改。该技术因其高特异性、精准性和灵活性，现已成为基因功能研究、疾病模型构建及基因治疗的关键核心工具。

一、KI小鼠的构建

1.基因设计：研究人员聚焦于小鼠APP基因的外显子16，一方面引入瑞典双突变（K670N/M671L），另一方面实施部分人源化（G676R/F681Y/R684H）操作；与此同时，针对小鼠PS1基因的外显子5，既引入了M146V突变，又开展人源化（I145V）工作。

2.CRISPR编辑：研究人员运用CRISPR Web工具设计出特异性sgRNA，精心筛选出低脱靶风险的引导序列，并从NOD雌鼠身上收集受精卵。接着，把Cas9蛋白、sgRNA以及人类化供体DNA共同注入小鼠受精卵，凭借同源定向修复（HDR）技术达成精准敲入目的。而后，将完成编辑的受精卵移植到假孕母鼠子宫内，使其生长直至小鼠出生。

3.基因型鉴定与纯合化步骤 ：

基因型鉴定 ：待小鼠断奶之际，采集其耳组织，通过碱性裂解法提取DNA，采用特异性引物对目标基因片段实行PCR扩增，对扩增后的PCR产物进行纯化操作，再开展桑格测序，进而确定APP和PS1突变位点以及人源化序列。

纯合化操作 ：安排杂合子小鼠与NOG小鼠进行回交，筛选获取纯合单敲入APP（NA）和PS1（NPS）的小鼠个体，随后让NA小鼠与NPS小鼠交配，最终筛选出纯合双敲入APP/PS1（NAPS）的小鼠。

图1.桑格测序证实了小鼠APP外显子16和PS 1外显子5中病理性突变（红框）和人源化（绿色框）核苷酸的成功替换

二、病理表型验证

1.蛋白质表达分析

借助Western blot技术检测小鼠皮质组织里的FL-APP（使用6E10抗体）、CTF-β片段，以此验证突变是否导致APP出现异常切割现象。

2.ELISA

对可溶性与不可溶性淀粉样蛋白 - β42水平进行测定，结果显示，NAPS 小鼠的淀粉样蛋白负荷达到了 NA 小鼠的两倍。

3.组织病理学

①免疫组化（IHC）进行6E10抗体染色，结果显示3月龄小鼠皮质和海马区出现细胞内Aβ沉积，并随年龄增长加重。

②神经元丢失与脑萎缩：NeuN/MAP2染色结果显示，NA和NAPS小鼠皮质及海马神经元显著丢失。

③MRI扫描：12月龄NA小鼠皮质体积减少，脑室扩张。

④行为学测试：Y迷宫：12月龄NAPS小鼠自发交替率降低，提示空间记忆受损。

三、人类免疫系统重建

在人类免疫系统重建相关研究中，研究人员对出生0 - 3天的NA小鼠先进行1 Gy X光辐射，持续4小时后，经肝内注射人CD34+造血干细胞（HSC）。12周之后，分别采集NA小鼠以及NOG对照小鼠的颊静脉血，运用流式细胞术检测外周血中的CD45+、CD3+、CD19+等标志性人源免疫细胞是否成功定植。实验结果显示，在HSC重建后的NOG小鼠与NA小鼠之间，未观察到显著差异，并且HSC重建举措并未对Aβ负荷产生显著影响。

图2.NA小鼠人免疫重建示意图

图3.HSC重建未显著改变Aβ负荷

总结与展望

总体而言，该研究凭借CRISPR-Cas9敲入技术，成功构建出免疫缺陷背景下的APP/PS1敲入小鼠模型，有效模拟出神经元内Aβ沉积、小胶质激活以及广泛神经元丢失等AD关键病理特征，同时拥有重建人类免疫系统的潜力。尽管在模拟斑块形成和行为学缺陷方面有所不足，但该小鼠模型在助力探究病理机制以及评估免疫治疗效果等方面，展现出巨大的应用潜力，为阿尔茨海默病（AD）研究范畴注入了更贴近人类的新活力。