遗传性视网膜疾病基因治疗将何去何从？

本文转自微信公众号：国际眼科时讯

原标题为《遗传性视网膜疾病基因治疗将何去何从？——李文生教授再评Leber先天性黑矇基因治疗的最新现状与挑战》

专家简介：李文生，上海爱尔眼科医院副院长，著名白内障及玻璃体视网膜专家，教授，博士，博士生导师。擅长各种疑难复杂性玻璃体视网膜疾病；超高度近视眼；各种疑难复杂性白内障手术。

Leber先天性黑矇（Leber's congenital amaurosis, LCA）对于患者来说是一种极其痛苦的致盲眼疾。

请您简要介绍一下基因治疗LCA的原理和方法，并谈谈设立此研究的初衷？

从1994年美国Li Tiansen（我在NIH的导师）等首先将腺病毒载体注射到正常和视网膜变性小鼠视网膜下腔开始，在十多年大量临床前研究基础上，2007年美国和英国三个研究小组率先启动了由RPE65基因突变引起的LCAⅡ型患者基因治疗临床试验，并于2008年报道了初步结果，认为基因治疗能够挽救患者的部分视功能，标志着HRD基因治疗已经开始。

从2008年开始首先报道LCAⅡ型临床试验结果开始，到目前已经超过30多篇相关文献在国际主流医学杂志如The New England Journal of Medicine?等杂志上报道了LCAⅡ型患者临床试验的半年、一年、三年和最长六年的结果。

在上述证明AAV介导基因治疗LCAⅡ型安全性和有效性基础上，2017年12月，美国食品及药物管理局（FDA）批准了Spark Therapeutic公司生产的腺病毒载体靶向基因治疗药物Luxturna上市治疗LCAⅡ，2018年11月该疗法也获得了欧洲药品管理局（EMA）的批准。美国和欧洲相继批准Luxturna临床应用成为眼科基因治疗领域一个里程碑式的标志，也成为治疗HRD的一个突破点。

当然多项研究报道基因治疗可明显改善LCAⅡ视觉功能，但是我们也需要在总体水平进一步了解它。我们知道，评价临床治疗效果的金标准是RCT和Meta分析，因此，我团队的王雪博士就对已经发表的文章进行了系统评价，以便更好地了解人类LCAⅡ基因治疗的有效性。

基因治疗的原理和方法比较简单，就是通过视网膜下腔注射携带RPE65编码序列的腺相关病毒载体，弥补视网膜色素上皮细胞RPE65基因缺陷，维持正常的视循环，最终达到治疗目的。

这项系统性评价当中纳入了6项研究，能否介绍一下这6项研究所具备的特点？

由于LCA是最严重的HRD，患病率约为1/30,000~1/81,000，只占HRD的5%，可见LCA是非常罕见的疾病。LCA是导致儿童先天性双眼盲目的主要遗传性眼病(占10%~20%)，其中由RPE65基因突变引起的LCAⅡ约占所有LCA的6%，更是罕见病中的罕见病。在我们纳入的6篇文章中，其中仅1篇为RCT研究，另外5篇为前瞻性研究，但通过质量评价分析，5篇前瞻性研究被证明质量较佳，也可用于荟萃分析。

我们通过多个数据库以及临床试验注册网站同时搜索“基因治疗LCA”相关内容，排除临床前研究，会议摘要和综述等文章，筛选出结果中有报道视功能的研究论文；当多篇论文报告同一患病群体时，我们将其中最新最全的一篇论文纳入研究。

本研究是否进一步证实了基因治疗的有效性？

在我们的分析结果中，LCAⅡ基因治疗的有效性是复杂的，需要具体讨论。在最佳矫正视力方面，RPE65基因治疗可短期内（两年之内）明显改善患者视功能，特别是对于基线视力较好的患者效果更佳。当然2015年美国Jacobson等人的研究表明：LCAⅡ型基因治疗患者治疗区域的视敏度在治疗以后都有提高，并且可以维持到治疗以后的1～3年，不幸的是，治疗以后的4.5～6年所有患者曾经提高的视敏度逐渐消失了，因此，这种改善效果无法长期维持。FST检测结果分析基因治疗对不同类型感光细胞的功能改善效果，得出RPE65基因治疗更倾向于改善视杆细胞功能的结论。最后，对在体视网膜结构分析表明，目前的基因治疗手段还不能有效逆转患者的视网膜退行性病变。但是由于LCAⅡ是罕见病，发病率极低，其中RCT研究更是有限。除了最佳矫正视力以外，无数据支持其他研究结果的亚组分析，即无法根据患者病情具体讨论基因治疗有效性，这是本研究无法克服的一个缺点。

基因治疗是否适合所有的LCA患者？

目前基因治疗主要针对单基因隐性HRD 的研究，基因治疗理论上适合包括LCA患者在内的所有HRD患者。但是鉴于HRD具有高度临床和遗传学异质性，特别是光感受器变性的多元机制，特别是在疾病的终末期，当外层视网膜结构损伤严重时（视网膜重编程），不管是基因治疗还是干细胞治疗都无法再生大部分感光细胞，因此也无法改善此类患者的视功能。鉴于此，我在差不多2012年左右就提出来一个观点，那就是应该对于不同的HRD甚至是对同一种疾病的不同阶段，我们应该探讨把基因治疗、干细胞治疗以及神经保护等结合起来的综合防治措施。我们目前发表的研究结果也证实了我当年提出来的假说。目前，我的团队正在进行这样的联合治疗研究。

基因治疗在较疑难的眼底疾病领域的应用前景？

HRD是眼科领域真正的“硬骨头”。毫无疑问，基因治疗是未来治疗HRD最根本的方法。在LCAⅡ型基因治疗取得初步成功的基础上，国外又接着进行了由MERTK （RP38）基因突变引起的视网膜色素变性（RP）、由ABCA4基因突变引起的Stargardt病、由CHM基因突变引起的无脉络膜症Choroideremia、由MYO7A基因突变引起的Ush1B型视网膜色素变性、由RS1基因突变引起的X-连锁视网膜劈裂以及由CNGB3基因突变引起的全色盲I 型等6个基因治疗临床试验。

在以上这些临床试验中，由RP38基因突变引起的RP报告了1年的结果，由CHM基因突变引起的先天性无脉络膜症报告了2年和4年的结果，CNGA3基因相关性全色盲也有4年的初步结果，但是其它如Stargardt病、X-连锁视网膜劈裂、Ush1B型视网膜色素变性还没有正式的临床试验报告。从这些已经报告的结果来看，大部分治疗效果还是比较肯定的，其中MacLaren等人报告的6名无脉络膜症患者经过基因治疗以后4年多的追踪观察，发现其中两名患者的视力得到明显改善，且疗效持续了4年之久，而他们未接受治疗的另一只眼睛的视力则在缓慢衰退。另外3名患者接受治疗眼的视力在4年中没有衰退。

目前基因治疗LCA在我国临床应用面临哪些挑战？

从世界范围来看，长期以来占据HRD不能治疗的传统观念已经被目前临床试验结果所颠覆，以LCAⅡ型为代表的临床试验结果表明HRD基因治疗安全、有效，发展潜力巨大！毫无疑问，包括LCA等在内的HRD基因治疗将迎来一个全新的时代！可惜目前我国还没有在临床上开展HRD的基因治疗，说明我国在该领域与世界前沿还是有一定差距，因此应尽快引进该项技术造福我国的患者。

HRD的基因治疗虽然取得了突破性的进展，但是仍然面临以下主要挑战：

首先，临床试验结果表明基因治疗本身不能阻止视网膜变性的进一步发展。

其次，目前采用的视网膜下腔注射治疗方法有待改进。由于该方法已经造成了黄斑裂孔、视网膜脱离等严重并发症。需要设计出转染效率更高、特异性更强的载体，即通过玻璃体腔注射就可转染到相应视网膜组织细胞，而不必通过视网膜下腔注射，以便尽量减少对非常敏感黄斑部特别是中心凹处残留锥细胞造成损害，从而影响视功能恢复。因此通过开发玻璃体腔注射达到能转染视网膜外层细胞的载体是当务之急。这方面的研究目前我们正在与中科院苏州生物工程研究所的张春教授合作，正在推进之中。

第三，目前使用的AAV载体只能承载致病基因中DNA序列长度小于4.7kb的基因，而致病基因中DNA序列长度超过4.7kb的基因均不能使用AAV作为载体，例如在LCA基因突变中所占比例最高和DNA序列最长的CEP290基因（约为8.9 kb）等，因此，对于由致病基因中DNA序列长度大于4.7kb的HRD，目前仍然需要寻找合适的载体。

第四，每眼每次治疗费用为42.5万美元的巨额费用也进一步限制了临床应用。

LCA成功进行基因治疗临床试验的经验启发：

首先我们要争取和创造条件，成立中国HRD基因治疗临床试验协作组，指导、规范、组织和实施中国HRD基因治疗的临床试验，包括共同从国家层面获取临床试验经费；

其次就某一病种HRD来说，发病率都很低，从LCA基因治疗临床试验可以看出，多中心，甚至国际间合作是开展HRD基因治疗临床试验所必须选择的手段，仅仅依靠1～2个单位的力量很难组织实施HRD基因治疗的临床试验；

此外LCA基因治疗的临床试验是国外学者在小鼠、犬等动物模型上进行了十余年大量临床前研究的基础上进行的，没有多年临床前实验研究的积累，是无法启动和实施的。

因此，我们也需要加强HRD的临床前研究，为以后独立开展HRD基因治疗的临床试验积累研究资料。

我相信只要我们能够充分利用我国丰富HRD资源，抓住机遇，团结协作，尽快启动和实施HRD基因治疗临床试验，不仅可以造福于广大中国HRD患者，同时对国际上正在进行的人类基因治疗研究也将是一个重要贡献。